Das 96-Well-Format: Abmessungen, Volumina und Well-Anordnung, nachgelesen in der ANSI/SLAS-Norm

Was ist das 96-Well-Format?

Eine 96-Well-Platte ist ein Spritzgussträger mit acht Reihen zu zwölf Spalten, dessen äußere Geometrie jedes Lesegerät, jeder Wäscher, jeder Versiegler und jeder Pipettierautomat im Haus bereits erwartet. Thermo Fisher beschreibt die Anordnung seiner Nunc-MicroWell-Platte als 8 × 12.

Diese Geometrie hat sich nicht zufällig eingebürgert. Festgelegt wird sie durch amerikanische nationale Normen, die der SLAS-Beratungsausschuss für Mikrotiterplattennormen pflegt und dessen Zusammensetzung das ANSI ausgewogen verlangt: Plattenhersteller, Hersteller von Geräten, die Mikrotiterplatten verwenden, industrielle und akademische Anwender sowie Mitglieder mit allgemeinem Interesse, die in keine dieser Gruppen fallen. In Kraft sind fünf Normen, die der Ausschuss im Juni 2017 bestätigt hat.

Die Nummerierung überspringt die 5. Alle vier Normen von 2004 erschienen ursprünglich als ANSI/SBS, eine Bezeichnung, die in vielen Anbieterkatalogen weiterhin gedruckt steht und in reichlich älterer Dokumentation wiedergegeben wird.

Wer die Liste ein zweites Mal liest, erkennt den Zuschnitt des Ganzen. Außenmaße, Höhe, Flansch, Well-Position, Well-Bodenhöhe. Jede einzelne beschreibt die Außenseite der Platte oder die Lage der Wells, und keine beschreibt, was ein Well ist. Diese Unterscheidung zieht sich durch den Rest dieser Seite, weil sie eine Zahl, auf die Sie einen Anbieter festnageln können, von einer Zahl trennt, die auf die Platte auf Ihrer Bank eben zufällig zutrifft.

Abmessungen einer 96-Well-Platte: Außenmaße, Höhe und Flansch

Drei Bedingungen gehören zu diesen Werten und werden weit seltener zitiert, als sie es verdienen.

Sie gelten bei 20 °C. ANSI/SLAS 1-2004 hält fest, dass ohne anderslautende Angabe alle Maße bei 20 Grad C (68 Grad F) gelten und dass für Messungen bei anderen Temperaturen kompensiert werden darf. Polystyrol arbeitet mit der Temperatur so weit, dass eine frisch aus dem 37-°C-Inkubator genommene Platte nicht mehr die Platte ist, die die Norm beschreibt.

Formschrägen sind nicht enthalten. Alle Normen tragen denselben Hinweis: Maße und Toleranzen schließen die Formschräge nicht ein. Spritzgegossene Wände laufen konisch zu, und diese Konizität liegt außerhalb der Toleranz, nicht innerhalb.

Die Auflagefläche muss durchgehend sein. ANSI/SLAS 1-2004 verlangt, dass die Auflagefläche rund um den Plattenboden durchgehend und ununterbrochen verläuft, weil erst das einem Greifer erlaubt, die Platte von jeder Seite aufzunehmen.

Die Flanschhöhen sind eine Auswahl und kein einzelner Wert. Eine Platte kann den niedrigen Flansch mit 2,41 mm tragen, den mittleren mit 6,10 mm, den hohen mit 7,62 mm, einen niedrigen Flansch mit Unterbrechungen oder zwei Höhen zugleich: 2,41 mm an den Schmalseiten und 7,62 mm an den Längsseiten. Wo eine einzelne Höhe verwendet wird, muss sie an allen vier Seiten gleich sein. Dieses Maß ist am häufigsten der Grund dafür, dass eine maßlich einwandfreie Platte in einem bestimmten Stapler dennoch nicht sitzt.

Wo die Wells sitzen: der A1-Versatz und das Rastermaß von 9 mm

ANSI/SLAS 4-2004 legt zwei Versatzmaße und einen Abstand fest, und alles Weitere am Raster folgt daraus. Der Mittelpunkt von Well A1 liegt 14,38 mm vom Bezug der Schmalseite und 11,24 mm vom Bezug der Längsseite entfernt. Die Well-Mittelpunkte stehen 9 mm auseinander. Für alle 96 Wells gilt eine Positionstoleranz von ⌀0,70 mm.

Die Rechnung schließt sich, was beim Zeichnen einer Platte oder beim Schreiben von Code, der Wells adressiert, eine brauchbare Kontrolle ergibt. Zwölf Spalten ergeben elf Abstände, das Raster überspannt also 11 × 9 = 99 mm; 14,38 + 99 + 14,38 ergibt 127,76, die Außenlänge. Acht Reihen ergeben sieben Abstände, also 7 × 9 = 63 mm; 11,24 + 63 + 11,24 ergibt 85,48, die Außenbreite. Das Well-Feld sitzt mittig auf der Platte, und zentriert wird es durch die beiden Versatzmaße.

Das Rastermaß von 9 mm ist auch der Grund, warum die Plattenformate ineinander aufgehen. ANSI/SLAS 2-2004 führt das Rastermaß nach Format auf, und jede Stufe halbiert die vorherige.

Eine 384-Well-Platte trägt ihre Wells im halben Rastermaß einer 96er, und genau deshalb kann ein 96-Kanal-Kopf ohne mechanische Änderung einen Quadranten einer 384-Well-Platte adressieren. Diese Halbierung ist der eigentliche Grund, warum die dichteren Formate so festgelegt wurden.

ANSI/SLAS 4-2004 enthält außerdem eine Anforderung, die leicht übersehen wird, weil sie die Kennzeichnung und nicht die Geometrie betrifft: Das Well oben links muss deutlich gekennzeichnet sein, etwa links durch den Buchstaben „A“ oder die Ziffer „1“ oder oben durch die Ziffer „1“. Zusätzliche Kennzeichnungen sind zulässig. Die alphanumerische Beschriftung, die den meisten Platten eingeprägt ist, erweitert dieses Minimum auf Initiative des Herstellers.

Wie viel fasst eine 96-Well-Platte?

Hier hören die Normen auf, und die Frage hat keine einzelne Antwort mehr. Keine der fünf legt ein Well-Volumen fest.

Das Gesamtvolumen dieser vier reicht von 330 µL bis 400 µL, eine Spanne von rund 20 %, und alle vier sind 96-Well-Platten im Standardformat. Zwei davon stammen vom selben Anbieter und unterscheiden sich um 30 µL aus keinem anderen Grund als der Form des Well-Bodens.

Das Arbeitsvolumen ist die Zahl, um die herum ein Versuch geplant wird, und es fällt aus Gründen enger aus, die mit der Platte nichts zu tun haben: Meniskus, Oberflächenspannung, der Freiraum, den eine Dispensierspitze braucht, und das Risiko der Kreuzkontamination, wenn eine Platte auf einem Deck bewegt wird. Corning empfiehlt für Flach- wie Rundboden 75 bis 200 µL und nennt für die zellkulturbehandelte 3596 gesondert 100 bis 200 µL als empfohlenes Medienvolumen. Greiner gibt für die CELLSTAR 655180 mit 25 bis 340 µL eine weitere Spanne an, deren Chimney-Well-Bauweise benachbarte Wells vollständiger trennt als eine gemeinsame Oberseite.

Praktische Folge: Ein Protokoll, das „jedes Well auf 300 µL auffüllen“ vorgibt, lässt sich ohne Prüfung auf keine dieser Platten übertragen. Bei der Corning 3788 überschreitet es das Gesamtvolumen des Wells.

Warum die Wachstumsfläche nicht überall 0,32 cm² beträgt

Die Wachstumsfläche pro Well ist die zweite Zahl, wegen der Leserinnen und Leser hier landen, und auch sie gehört dem Hersteller und nicht der Norm.

Die beiden liegen rund 6 % auseinander. Für die meisten Zwecke ist das Rauschen. Für alles, was auf die Flächeneinheit bezogen wird, ist es das nicht: Aussaatdichte in Zellen pro cm², Proteinausbeute pro cm², eine spezifische Aktivität, die auf die Wachstumsfläche bezogen berichtet wird. Eine Zahl, die zwischen zwei Laboren mit nominell gleichen Platten weitergegeben wird, erbt diese 6 % stillschweigend, und das „ca.“, mit dem Corning seinen Wert versieht, ist eine berechtigte Warnung und keine Formel, über die man hinweglesen sollte.

Beachtenswert ist auch, was die Rundbodenplatte nicht hat. Corning gibt für die behandelte Flachbodenplatte 3596 eine Wachstumsfläche an und für die unbehandelte Rundbodenplatte 3788 keine, was in sich stimmig ist: Die Wachstumsfläche ist eine Eigenschaft einer für adhärente Kultur bestimmten Oberfläche und keine geometrische Tatsache über ein Well.

Einen Plattenplan lesen: von A1 bis H12

Die Reihen laufen von oben nach unten von A bis H, die Spalten von links nach rechts von 1 bis 12, und eine Well-Bezeichnung besteht aus dem Reihenbuchstaben gefolgt von der Spaltenzahl. A1 ist das Well oben links, H12 das unten rechts. Damit ist die Konvention vollständig, und der einzige Teil davon, den die Normen verlangen, ist die deutliche Kennzeichnung des Wells oben links.

Daraus, dass der Rest Gewohnheit und nicht Vorschrift ist, ergeben sich zwei Folgen.

Die Orientierung trägt die Platte, nicht der Plan. Eine im Halter um 180° gedrehte Platte trägt ihre A1-Ecke weiterhin gekennzeichnet, und diese Kennzeichnung ist das Einzige, was einem Lesegerät oder einer Bedienperson sagt, um welche Ecke es sich handelt. Ein Plattenplan ohne ausdrücklichen A1-Marker bleibt genau auf die Weise mehrdeutig, die die Norm verhindern wollte.

Die Durchlaufrichtung ist eine örtliche Festlegung. Spaltenweise lesen (A1, B1, C1 …) und reihenweise lesen (A1, A2, A3 …) sind beide verbreitet, die Gerätesoftware ist sich uneinig darüber, was sie exportiert, und keine der beiden ist richtiger. Es lohnt sich anzugeben, welche ein Datensatz verwendet, denn der Unterschied transponiert ein 8 × 12-Raster stillschweigend.

Was die Normen bewusst offenlassen

ANSI/SLAS 6-2012 ist die Norm, die das Ausgelassene ausdrücklich macht, und sie verdient eine genaue Lektüre, weil ihr Titel mehr verspricht, als sie festlegt. Sie gilt für Mikrotiterplatten mit flachem Well-Boden und definiert ein Vokabular: Well-Bodenhöhe, Schwankung dieser Höhe, Schwankung innerhalb eines Wells, Well-Bodenbreite, Well-Tiefe, Bodendicke. Als Zweck nennt sie, diese Definitionen zu beschreiben und die Bedingungen darzulegen, unter denen die erforderlichen Messungen vorzunehmen sind.

Das ist also eine Messnorm. Zur Well-Bodenbreite hält sie fest, dass bis zur theoretisch scharfen Ecke gemessen und der Wert als Nennwert angegeben wird. Festzulegen, wie ein Maß anzugeben ist, heißt nicht, einen bestimmten Wert zu fordern, und keine der fünf Normen fordert einen.

Genau gelesen, formulieren die Anbieter das präzise. Greiner Bio-One gibt an, dass die CELLSTAR-Mikrotiterplatten eine einheitliche Auflagefläche haben, die der Empfehlung des American National Standards Institute entspricht, und nennt dabei ausdrücklich ANSI/SBS 1-2004. Das ist eine Aussage über die Norm der Außenmaße, und es ist genau die Aussage, die diese Norm trägt. Die Wachstumsfläche von 34 mm² und das Arbeitsvolumen von 25 bis 340 µL auf derselben Seite sind Greiners eigene Werte, angeboten als Produktspezifikation und nicht als Konformität mit irgendetwas.

Daraus folgt für einen Methodenteil oder eine Abbildungslegende: Nennen Sie die Katalognummer, nicht das Format. „Eine 96-Well-Platte“ benennt die Außenmaße und die Well-Positionen. Sie benennt weder Volumen noch Wachstumsfläche, weder Well-Form noch Oberfläche, und genau das sind meist die Eigenschaften, die eine Leserin bräuchte, um die Arbeit zu wiederholen.

Eine normgerechte 96-Well-Platte zeichnen

Zeichnen Sie im Maßstab 1:1 in Millimetern, dann wird die Spezifikation zur Zeichnung, statt dass die Zeichnung sie annähert. Der Umriss ist ein Rechteck von 127,76 auf 85,48 mit Eckradien von 3,18 mm. Well A1 liegt bei 14,38, 11,24. Jedes weitere Well ist dieser Punkt zuzüglich eines Vielfachen von 9 in jeder Richtung. Die Abbildung am Anfang dieser Seite ist aus genau diesen Zahlen und aus sonst nichts aufgebaut.

Vier Fehler treten in veröffentlichten Plattenabbildungen häufig genug auf, um sie zu benennen.

Das vertauschte Raster. Zwölf Spalten in der Breite, acht Reihen in der Höhe. Eine mit 12 Reihen und 8 Spalten gezeichnete Platte ist ein anderes Objekt, und der Fehler entsteht meist, wenn eine Abbildung aus einer Tabellenkalkulation aufgebaut wird, deren Ausrichtung niemand geprüft hat.

A1 in der falschen Ecke. Oben links. Wird eine Abbildung nach einer Fotografie der Platte auf der Bank gezeichnet, kann die Platte durchaus gedreht gelegen haben.

Wells von Kante zu Kante verteilt. Die Wells gleichmäßig über die volle Breite zu setzen, statt den ersten Mittelpunkt um 14,38 mm einzurücken und in Schritten von 9 mm weiterzugehen, ergibt eine Platte, die richtig aussieht und zu nichts passt. Zentriert wird das Feld durch die beiden Versatzmaße.

Ein Well-Durchmesser, der als Spezifikation auftritt. Jede Plattenabbildung muss die Wells in irgendeiner Größe zeichnen. Anzugeben, welche Platte gezeichnet wurde, oder den Durchmesser als Nennmaß zu kennzeichnen, ist die ehrliche Variante. Die Abbildung oben wählt die zweite.

Bei einer Abbildung, die Maße transportiert, erhält die Vektorausgabe sie. Unser Leitfaden zur Erstellung wissenschaftlicher Abbildungen für die Publikation behandelt Auflösung, Strichstärke und Schriftgrad, die eine Verkleinerung auf eine Zeitschriftenspalte überstehen, und dieselben Regeln gelten für ein Plattenschema wie für ein Diagramm.

Häufige Fragen

Welche Abmessungen hat eine 96-Well-Platte? 127,76 mm × 85,48 mm mit vier Eckradien von 3,18 ± 1,6 mm nach ANSI/SLAS 1-2004 und eine typische Höhe von 14,35 mm ± 0,76 mm nach ANSI/SLAS 2-2004. Insgesamt gilt eine Toleranz von ± 0,5 mm, in den Bezugszonen verengt auf ± 0,25 mm, und die Maße gelten bei 20 °C.

Wie groß ist das Rastermaß? 9 mm zwischen den Mittelpunkten, in beide Richtungen. ANSI/SLAS 2-2004 führt 9 mm für 96 Wells auf, 4,5 mm für 384 und 2,25 mm für 1536, jeweils die Hälfte des vorherigen Werts.

Wo liegt Well A1? Oben links, mit dem Mittelpunkt 14,38 mm vom Bezug der Schmalseite und 11,24 mm vom Bezug der Längsseite entfernt, bei einer Positionstoleranz von ⌀0,70 mm. ANSI/SLAS 4-2004 verlangt, dass das Well oben links deutlich gekennzeichnet ist.

Wie viel Flüssigkeit fasst ein Well? Das hängt von der Platte ab, denn keine Norm legt es fest. Corning nennt 360 µL für die Flachbodenplatte 3596 und 330 µL für die Rundbodenplatte 3788, Thermo Fisher 400 µL für die Flachbodenplatte Nunc 167008. Die empfohlenen Arbeitsvolumina betragen 75 bis 200 µL bei den Corning-Platten und 25 bis 340 µL bei der Greiner CELLSTAR 655180.

Wie groß ist die Wachstumsfläche eines Wells? Rund 0,32 cm² bei Corning für die 3596 und 34 mm² bei Greiner Bio-One für die 655180. Beides sind Herstellerangaben und keine genormten Werte, und die Abweichung von etwa 6 % überträgt sich auf alles, was pro Flächeneinheit berichtet wird.

Ist das Well-Volumen überhaupt genormt? Nein. ANSI/SLAS 6-2012 definiert Well-Tiefe, Bodendicke und Well-Bodenbreite als Messbegriffe und hält fest, dass die Well-Bodenbreite als Nennwert angegeben wird. Die Norm regelt, wie diese Maße anzugeben sind, sie legt sie nicht fest.

Wie viele Reihen und Spalten gibt es? Acht Reihen von A bis H und zwölf Spalten von 1 bis 12. Thermo Fisher beschreibt die Anordnung als 8 × 12.

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