El formato de placa de 96 pocillos: dimensiones, volúmenes y disposición, leídos en la norma ANSI/SLAS

¿Qué es el formato de 96 pocillos?

Una placa de 96 pocillos es una bandeja moldeada de ocho filas por doce columnas cuya geometría exterior ya esperan todos los lectores, lavadores, selladores y manipuladores de líquidos del laboratorio. Thermo Fisher describe la matriz de su placa Nunc MicroWell como 8 × 12.

Esa geometría no es una costumbre que se asentara sola. La fijan normas nacionales estadounidenses que mantiene el comité asesor de normas de microplacas de SLAS, cuya composición exige ANSI que esté equilibrada entre fabricantes de microplacas, fabricantes de instrumentos que las utilizan, usuarios industriales y académicos, y miembros con interés general que no encajan en las categorías anteriores. Hay cinco normas en vigor, ratificadas por el comité en junio de 2017.

La numeración se salta el 5. Las cuatro normas de 2004 se publicaron originalmente como ANSI/SBS, designación que sigue impresa en muchos catálogos de proveedores y reproducida en abundante documentación antigua.

Al releer la lista se ve la forma del conjunto. Huella, altura, pestaña, posición de los pocillos, altura del fondo del pocillo. Cada una describe el exterior de la placa o dónde están los pocillos, y ninguna describe qué es un pocillo. Esa distinción recorre el resto de esta página, porque separa una cifra que se le puede exigir a un proveedor de una cifra que simplemente resulta cierta de la placa que hay en su poyata.

Dimensiones de una placa de 96 pocillos: huella, altura y pestaña

Tres condiciones acompañan a estos valores y se citan mucho menos de lo que deberían.

Valen a 20 °C. ANSI/SLAS 1-2004 indica que, salvo especificación en contrario, todas las cotas se aplican a 20 grados C (68 grados F) y que cabe compensar las mediciones hechas a otras temperaturas. El poliestireno se mueve lo suficiente con la temperatura como para que una placa medida al salir de un incubador a 37 °C ya no sea la placa que describe la norma.

Excluyen el ángulo de desmoldeo. Todas las normas llevan la misma nota: las cotas y tolerancias no incluyen el desmoldeo. Las paredes moldeadas por inyección se abren, y esa conicidad queda fuera de la tolerancia, no dentro.

La huella tiene que ser continua. ANSI/SLAS 1-2004 exige que la huella sea continua e ininterrumpida alrededor de la base de la placa, que es lo que permite a una pinza tomarla por cualquier lado.

Las alturas de pestaña son un menú, no un valor único. Una placa puede llevar la pestaña baja de 2,41 mm, la media de 6,10 mm, la alta de 7,62 mm, una pestaña baja con interrupciones, o dos alturas a la vez: 2,41 mm en los lados cortos y 7,62 mm en los largos. Cuando se adopta una altura única, debe ser la misma en los cuatro lados. Es la cota que con más frecuencia explica que una placa con medidas correctas siga sin asentar en un apilador concreto.

Dónde están los pocillos: el desplazamiento de A1 y el paso de 9 mm

ANSI/SLAS 4-2004 fija dos desplazamientos y un intervalo, y de ahí se deduce todo lo demás de la retícula. El centro del pocillo A1 queda a 14,38 mm de la referencia del lado corto y a 11,24 mm de la del lado largo. Los centros de pocillo distan 9 mm. A los 96 pocillos se les aplica una tolerancia de posición de ⌀0,70 mm.

La cuenta se cierra sobre sí misma, lo que da una comprobación útil al dibujar una placa o al escribir código que la direccione. Doce columnas dan once intervalos, así que la retícula abarca 11 × 9 = 99 mm; 14,38 + 99 + 14,38 son 127,76, la longitud exterior. Ocho filas dan siete intervalos, o sea 7 × 9 = 63 mm; 11,24 + 63 + 11,24 son 85,48, la anchura exterior. La matriz de pocillos está centrada en la placa, y son los dos desplazamientos los que la centran.

El paso de 9 mm explica también por qué encajan unos formatos en otros. ANSI/SLAS 2-2004 tabula el paso por formato, y cada escalón vale la mitad del anterior.

Una placa de 384 pocillos coloca los suyos a la mitad del paso de una de 96, y eso permite que un cabezal de 96 canales direccione un cuadrante de una placa de 384 sin ningún cambio mecánico. Esa relación de dos es justamente la razón de que los formatos de mayor densidad se normalizaran así.

ANSI/SLAS 4-2004 incluye además un requisito fácil de pasar por alto porque trata del marcado y no de la geometría: el pocillo superior izquierdo debe estar claramente marcado, por ejemplo a la izquierda con la letra «A» o el número «1», o arriba con el número «1». Se admiten marcas adicionales. La codificación alfanumérica moldeada en la mayoría de las placas es una extensión de ese mínimo por parte del fabricante.

¿Cuánto volumen admite una placa de 96 pocillos?

Aquí las normas se detienen y la pregunta deja de tener una respuesta única. Ninguna de las cinco fija el volumen de un pocillo.

El volumen total de esas cuatro va de 330 µL a 400 µL, un margen de alrededor del 20 %, y las cuatro son placas de 96 pocillos en formato estándar. Dos de ellas proceden del mismo proveedor y difieren en 30 µL por ningún otro motivo que la forma del fondo del pocillo.

El volumen de trabajo es la cifra sobre la que diseñar un experimento, y es más estrecha que la total por razones ajenas a la placa: menisco, tensión superficial, holgura que necesita una punta de dispensación y riesgo de contaminación cruzada cuando la placa se desplaza sobre una plataforma. Corning recomienda de 75 a 200 µL tanto para la de fondo plano como para la de fondo redondo, y aparte da de 100 a 200 µL como volumen de medio recomendado para la 3596 tratada para cultivo. Greiner da un rango más amplio, de 25 a 340 µL, para la CELLSTAR 655180, cuya construcción de pocillo en chimenea separa los pocillos vecinos más completamente que una superficie superior compartida.

La consecuencia práctica: un protocolo que dice «llenar cada pocillo hasta 300 µL» no se traslada tal cual a ninguna de estas placas sin comprobarlo. En la Corning 3788 supera el volumen total del pocillo.

La superficie de cultivo no es 0,32 cm² en todas partes

La superficie de cultivo por pocillo es la otra cifra que los lectores vienen a buscar, y también es del fabricante y no de la norma.

La diferencia ronda el 6 %. Para la mayoría de los usos es ruido. Para cualquier cosa normalizada por unidad de superficie no lo es: densidad de siembra en células por cm², rendimiento proteico por cm², actividad específica referida a la superficie de cultivo. Una cifra que viaja entre dos laboratorios con placas nominalmente idénticas hereda ese 6 % en silencio, y el «aprox.» con que Corning matiza su valor es una advertencia razonable, no una cautela que convenga ignorar.

Conviene fijarse también en lo que la placa de fondo redondo no tiene. Corning indica superficie de cultivo para la 3596 de fondo plano y tratada, y ninguna para la 3788 de fondo redondo sin tratar, lo cual es coherente: la superficie de cultivo es una propiedad de una superficie destinada al cultivo adherente, no un hecho geométrico sobre un pocillo.

Cómo leer un mapa de placa: de A1 a H12

Las filas van de la A a la H de arriba abajo, las columnas del 1 al 12 de izquierda a derecha, y el identificador de un pocillo es la letra de fila seguida del número de columna. A1 es el pocillo superior izquierdo y H12 el inferior derecho. La convención se agota ahí, y lo único que exigen las normas es que el pocillo superior izquierdo esté claramente marcado.

De que el resto sea costumbre y no especificación se siguen dos consecuencias.

La orientación la lleva la placa, no el mapa. Una placa girada 180° en un portaplacas conserva marcada su esquina A1, y esa marca es lo único que indica a un lector o a un operario de qué esquina se trata. Un mapa de placa dibujado sin un marcador A1 explícito queda ambiguo exactamente del modo que la norma pretendía evitar.

El orden de recorrido es una elección local. Leer por columnas (A1, B1, C1, etc.) y leer por filas (A1, A2, A3, etc.) son ambos habituales, el software de los instrumentos discrepa sobre cuál exporta y ninguno es más correcto. Merece la pena indicar cuál usa un conjunto de datos, porque la diferencia traspone en silencio una retícula de 8 × 12.

Lo que las normas dejan abierto deliberadamente

ANSI/SLAS 6-2012 es la norma que hace explícita la omisión, y merece una lectura atenta porque su título sugiere que fija más de lo que fija. Se aplica a microplacas con fondo de pocillo plano y define un vocabulario: altura del fondo del pocillo, variación de esa altura, variación dentro de un mismo pocillo, anchura del fondo del pocillo, profundidad de pocillo y espesor de fondo. El propósito que declara es describir esas definiciones y exponer las condiciones necesarias para efectuar las mediciones.

Es, por tanto, una norma de medición. Sobre la anchura del fondo del pocillo señala que se mide hasta la esquina viva teórica y se comunica como valor nominal. Definir cómo debe comunicarse una cota no equivale a exigir que tome un valor determinado, y ninguna de las cinco normas exige uno.

Leídos con atención, los proveedores son precisos en esto. Greiner Bio-One indica que sus microplacas CELLSTAR presentan una huella uniforme conforme a la recomendación del American National Standards Institute, y nombra específicamente ANSI/SBS 1-2004. Es una afirmación sobre la norma de huella, y es exactamente la afirmación que esa norma respalda. La superficie de cultivo de 34 mm² y el volumen de trabajo de 25 a 340 µL que figuran en la misma página son cifras propias de Greiner, ofrecidas como especificaciones de producto y no como conformidad con nada.

De aquí sale la regla para un apartado de métodos o un pie de figura: cite la referencia de catálogo, no el formato. «Una placa de 96 pocillos» identifica la huella y la posición de los pocillos. No identifica el volumen, la superficie de cultivo, la forma del fondo ni el tratamiento de superficie, que suelen ser las propiedades que un lector necesitaría para repetir el trabajo.

Dibujar una placa de 96 pocillos conforme a la norma

Dibújela a escala 1:1 en milímetros y la especificación pasa a ser el dibujo, en lugar de algo que el dibujo aproxima. El contorno es un rectángulo de 127,76 por 85,48 con radios de esquina de 3,18 mm. El pocillo A1 va en 14,38, 11,24. Todos los demás son ese punto más un múltiplo de 9 en cada dirección. La figura del principio de esta página está construida exactamente con esas cifras y con ninguna otra.

Hay cuatro errores que aparecen con la frecuencia suficiente en figuras de placas publicadas como para nombrarlos.

La retícula traspuesta. Doce columnas a lo ancho y ocho filas a lo alto. Una placa dibujada con 12 filas y 8 columnas es otro objeto, y ocurre sobre todo cuando la figura se monta desde una hoja de cálculo cuya orientación nadie comprobó.

A1 en la esquina equivocada. Arriba a la izquierda. Si la figura se dibuja a partir de una fotografía de una placa sobre la poyata, la placa bien pudo estar girada.

Pocillos repartidos de borde a borde. Espaciarlos de manera uniforme por toda la anchura, en lugar de meter el primer centro 14,38 mm y avanzar de 9 en 9 mm, produce una placa que parece correcta y no coincide con nada. Son los dos desplazamientos los que centran la matriz.

Un diámetro de pocillo presentado como especificación. Cualquier figura de placa tiene que dibujar los pocillos con algún tamaño. Indicar qué placa se ha dibujado, o calificar el diámetro de nominal, es la versión honesta. La figura de arriba toma la segunda vía.

En una figura que transporta medidas, lo que las preserva es la salida vectorial. Nuestra guía sobre cómo preparar figuras científicas para publicación trata la resolución, el grosor de línea y el cuerpo tipográfico que sobreviven a la reducción a una columna de revista, y las mismas reglas valen para un esquema de placa igual que para una gráfica.

Preguntas frecuentes

¿Cuáles son las dimensiones de una placa de 96 pocillos? 127,76 mm × 85,48 mm, con cuatro radios de esquina de 3,18 ± 1,6 mm, según ANSI/SLAS 1-2004, y una altura típica de 14,35 mm ± 0,76 mm según ANSI/SLAS 2-2004. Se aplica una tolerancia de ± 0,5 mm en conjunto, que se estrecha a ± 0,25 mm en las zonas de referencia, y las cotas valen a 20 °C.

¿Cuál es el paso entre pocillos? 9 mm entre centros en ambas direcciones. ANSI/SLAS 2-2004 tabula 9 mm para 96 pocillos, 4,5 mm para 384 y 2,25 mm para 1536, cada valor la mitad del anterior.

¿Dónde está el pocillo A1? Arriba a la izquierda, con el centro a 14,38 mm de la referencia del lado corto y a 11,24 mm de la del lado largo, con tolerancia de posición de ⌀0,70 mm. ANSI/SLAS 4-2004 exige que el pocillo superior izquierdo esté claramente marcado.

¿Cuánto líquido admite un pocillo? Depende de la placa, porque ninguna norma lo fija. Corning da 360 µL para la 3596 de fondo plano y 330 µL para la 3788 de fondo redondo; Thermo Fisher da 400 µL para la Nunc 167008 de fondo plano. Los volúmenes de trabajo recomendados son de 75 a 200 µL en las placas de Corning y de 25 a 340 µL en la Greiner CELLSTAR 655180.

¿Cuál es la superficie de cultivo de un pocillo? Alrededor de 0,32 cm² en Corning para la 3596, y 34 mm² en Greiner Bio-One para la 655180. Ambas son especificaciones de fabricante, no valores normalizados, y la diferencia de en torno al 6 % se propaga a cualquier resultado que se informe por unidad de superficie.

¿Está normalizado el volumen de los pocillos? No. ANSI/SLAS 6-2012 define la profundidad de pocillo, el espesor de fondo y la anchura del fondo del pocillo como términos de medición, y señala que la anchura del fondo se comunica como valor nominal. Define cómo informar de esas cotas; no las fija.

¿Cuántas filas y columnas hay? Ocho filas de la A a la H y doce columnas del 1 al 12. Thermo Fisher describe la matriz como 8 × 12.

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