Generatore di volcano plot

Quali geni sono cambiati fra due condizioni, di quanto e con quale affidabilità, tutto insieme. Ogni punto è un gene: la sua posizione destra–sinistra è il log₂ fold change, la sua altezza il −log₁₀ del p-value. Più un punto sta in alto e lontano dal centro, più la variazione è grande e certa; la base grigia vicino allo zero sono i geni che non sono cambiati.

Leggi in orizzontale per l'entità e il verso della variazione (a destra aumenta, a sinistra diminuisce, ±1 è un raddoppio o un dimezzamento), poi in verticale per l'evidenza (1,3 è p = 0,05, e ogni unità sopra è dieci volte più piccola). I risultati significativi stanno nei due angoli superiori fuori dalle linee tratteggiate. L'esempio guidato qui sopra legge tutte e sei le regioni su un esempio di 20 geni.

|log₂FC| ≥ 1, una variazione di 2 volte, è la più comune; 0,58 (1,5 volte) si usa dove ci si aspettano effetti piccoli, come in proteomica, nei microarray o nei dati di singola cellula. La soglia è una scelta di presentazione, quindi indicala nella legenda della figura. Nel generatore di volcano plot scrivila nel prompt («|log2FC| > 0.58») o come variazione di N volte («1,5 volte»), che viene convertita in log₂.

Quello a cui è stata applicata la soglia di significatività, così la linea orizzontale significa ciò che dice la legenda. Con migliaia di geni analizzati, la maggior parte degli articoli applica la soglia e rappresenta il p corretto con Benjamini–Hochberg (padj, FDR, q). Il generatore di volcano plot intitola l'asse −log₁₀(p-value corretto) quando i valori sono corretti e −log₁₀(p-value) altrimenti.

Perché sono aumentati più geni di quanti ne siano diminuiti, o il contrario: un volcano plot è simmetrico solo quanto la biologia. Uno spostamento dell'intera base grigia lontano da x = 0 è un'altra cosa. Di solito indica un problema di normalizzazione e conviene verificarlo su un MA plot prima di leggere i risultati. Il generatore di volcano plot non rispecchia mai la nuvola per farla sembrare equilibrata.

I loro p-value erano troppo piccoli per essere memorizzati e sono stati scritti come 0, quindi −log₁₀ p è infinito e il software di disegno li blocca a una stessa altezza. Succede spesso con il p_val_adj di Seurat e con l'RNA-seq molto profondo. Il generatore di volcano plot disegna quei geni al p non nullo più piccolo della tabella e lo segnala sulla figura; riportarli come p < 10⁻³⁰⁰ è onesto, un valore esatto inventato no.

Con ggplot2, aggiungi una colonna di classe (up, down, not significant), poi ggplot(res, aes(log2FoldChange, -log10(padj), colour = class)) + geom_point() + geom_vline(xintercept = c(-1, 1), linetype = 2) + geom_hline(yintercept = -log10(0.05), linetype = 2), con ggrepel per le etichette. EnhancedVolcano racchiude gli stessi passaggi nei suoi argomenti pCutoff e FCcutoff. Per saltare il codice, allega al generatore di volcano plot la tabella salvata con write.csv().

Prism disegna automaticamente un volcano plot quando analizzi una tabella raggruppata con test t multipli (Prism 8 e successivi): i risultati includono un grafico della differenza contro −log₁₀ p. Da una tabella di risultati prodotta altrove, inserisci il log₂ fold change come X e il −log₁₀ p come Y in una tabella XY e aggiungi le linee di soglia come set di dati aggiuntivi, oppure allega quella tabella al generatore di volcano plot.

In Excel aggiungi una colonna =-LOG10(C2) accanto ai p-value, crea una dispersione XY del fold change contro quella colonna e aggiungi ogni linea di soglia come serie a sé di due punti; colorare le classi richiede una serie per classe. In Python, plt.scatter(df.log2FoldChange, -np.log10(df.padj), c=colours) con plt.axvline e plt.axhline fa lo stesso, e adjustText colloca le etichette. Il generatore di volcano plot accetta lo stesso foglio in .xlsx o .csv senza la colonna della formula.

Sì: il generatore di volcano plot legge i risultati di DESeq2, edgeR, limma, Seurat e Perseus dalle intestazioni delle colonne, da .csv, .tsv o .xlsx, fino a 60.000 righe. Le righe con NA vengono saltate, si usa il p corretto quando il file lo contiene, e una colonna Fold change semplice viene convertita in log₂.

No: il generatore di volcano plot legge i p-value dalla tua tabella e non esegue mai la statistica. Esegui il test in DESeq2, edgeR, limma o nel tuo software di proteomica; da quei numeri il generatore di volcano plot calcola esattamente −log₁₀ p, la classe di ogni gene, i conteggi, gli assi e le linee di soglia.

Per impostazione predefinita il generatore di volcano plot etichetta i dieci risultati più significativi, divisi fra il lato dei sovraespressi e quello dei sottoespressi. Scrivi «etichetta i primi 20», «nessuna etichetta», oppure indica i geni («evidenzia NANOG, SOX2 e MYC»); i geni indicati vengono etichettati anche quando sono grigi.

Il generatore di volcano plot accetta fino a 60.000 righe, abbastanza per un intero trascrittoma. Fino a 200 geni ogni punto è collocato alle sue coordinate esatte. Oltre, i geni più significativi (fino a 300) sono collocati esattamente e gli altri sono disegnati dai loro conteggi e dalla loro dispersione reali, fascia per fascia, mentre la legenda mantiene i conteggi esatti di sovraespressi, sottoespressi e non significativi.