Le format des plaques 96 puits : dimensions, volumes et disposition, relevés dans la norme ANSI/SLAS

Qu’est-ce que le format 96 puits ?

Une plaque 96 puits est un plateau moulé de huit rangées sur douze colonnes, dont la géométrie extérieure est déjà attendue par tous les lecteurs, laveurs, operculeurs et automates de pipetage du laboratoire. Thermo Fisher décrit la matrice de sa plaque Nunc MicroWell comme 8 × 12.

Cette géométrie ne relève pas d’un usage qui se serait installé de lui-même. Elle est fixée par des normes nationales américaines qu’entretient le comité consultatif SLAS sur les normes de microplaques, dont l’ANSI exige une composition équilibrée : fabricants de microplaques, fabricants d’instruments utilisant des microplaques, utilisateurs industriels et académiques, et membres n’appartenant à aucune de ces catégories. Cinq normes sont en vigueur, reconduites par le comité en juin 2017.

La numérotation saute le 5. Les quatre normes de 2004 ont d’abord paru sous l’appellation ANSI/SBS, encore imprimée dans beaucoup de catalogues fournisseurs et reprise dans quantité de documents anciens.

Relisez cette liste et la nature de l’ensemble apparaît. Encombrement, hauteur, collerette, position des puits, hauteur du fond de puits. Chacune décrit l’extérieur de la plaque ou l’emplacement des puits, aucune ne décrit ce qu’est un puits. Cette distinction traverse toute la suite de cette page, parce qu’elle sépare un chiffre que vous pouvez opposer à un fournisseur d’un chiffre qui se trouve simplement vrai de la plaque posée sur votre paillasse.

Dimensions d’une plaque 96 puits : encombrement, hauteur et collerette

Trois conditions accompagnent ces valeurs et se citent bien moins souvent qu’elles ne le mériteraient.

Elles valent à 20 °C. L’ANSI/SLAS 1-2004 précise que, sauf indication contraire, toutes les cotes s’appliquent à 20 degrés C (68 degrés F) et qu’une compensation reste possible pour des mesures faites à d’autres températures. Le polystyrène bouge assez avec la température pour qu’une plaque mesurée à la sortie d’un incubateur à 37 °C ne soit plus celle que décrit la norme.

Elles excluent la dépouille. Chaque norme porte la même note : cotes et tolérances n’incluent pas la dépouille. Les parois moulées par injection s’évasent, et cet évasement se situe en dehors de la tolérance, non dedans.

L’encombrement doit être continu. L’ANSI/SLAS 1-2004 exige que l’empreinte soit continue et ininterrompue tout autour de la base de la plaque, ce qui permet à une pince de saisir la plaque par n’importe quel côté.

Les hauteurs de collerette forment un menu plutôt qu’une valeur unique. Une plaque peut porter la collerette basse de 2,41 mm, la moyenne de 6,10 mm, la haute de 7,62 mm, une collerette basse interrompue, ou deux hauteurs à la fois : 2,41 mm sur les petits côtés et 7,62 mm sur les grands. Lorsqu’une hauteur unique est retenue, elle doit être identique sur les quatre côtés. C’est la cote qui explique le plus souvent qu’une plaque aux mesures correctes refuse malgré tout de se loger dans un empileur donné.

Où se trouvent les puits : le décalage de A1 et l’entraxe de 9 mm

L’ANSI/SLAS 4-2004 fixe deux décalages et un intervalle, et tout le reste de la grille en découle. Le centre du puits A1 se situe à 14,38 mm de la référence du petit côté et à 11,24 mm de celle du grand côté. Les centres de puits sont espacés de 9 mm. Une tolérance de position de ⌀0,70 mm s’applique aux 96 puits.

Le calcul se referme sur lui-même, ce qui fournit une vérification utile quand on trace une plaque ou qu’on écrit du code qui en adresse une. Douze colonnes donnent onze intervalles, la grille couvre donc 11 × 9 = 99 mm ; 14,38 + 99 + 14,38 fait 127,76, la longueur hors tout. Huit rangées donnent sept intervalles, soit 7 × 9 = 63 mm ; 11,24 + 63 + 11,24 fait 85,48, la largeur hors tout. Le réseau de puits est centré sur la plaque, et ce sont les deux décalages qui le centrent.

L’entraxe de 9 mm explique aussi l’emboîtement des formats. L’ANSI/SLAS 2-2004 tabule l’entraxe par format, et chaque palier vaut la moitié du précédent.

Une plaque 384 puits porte ses puits à la moitié de l’entraxe d’une 96, ce qui permet à une tête 96 canaux d’adresser un quadrant d’une plaque 384 sans aucune modification mécanique. Ce rapport de deux est la raison même pour laquelle les formats à plus haute densité ont été normalisés ainsi.

L’ANSI/SLAS 4-2004 porte aussi une exigence facile à manquer parce qu’elle relève du marquage et non de la géométrie : le puits supérieur gauche doit être clairement repéré, par exemple à gauche par la lettre « A » ou le chiffre « 1 », ou en haut par le chiffre « 1 ». Des marquages supplémentaires restent possibles. Le repérage alphanumérique moulé sur la plupart des plaques prolonge ce minimum à l’initiative du fabricant.

Quel volume contient une plaque 96 puits ?

Ici les normes s’arrêtent, et la question n’a plus de réponse unique. Aucune des cinq ne fixe le volume d’un puits.

Le volume total de ces quatre plaques s’étale de 330 µL à 400 µL, soit un écart d’environ 20 %, et toutes les quatre sont des plaques 96 puits au format standard. Deux d’entre elles viennent du même fournisseur et diffèrent de 30 µL pour la seule raison de la forme du fond de puits.

Le volume de travail est celui autour duquel concevoir une expérience, et il est plus étroit que le volume total pour des raisons étrangères à la plaque : ménisque, tension superficielle, garde nécessaire à une pointe de distribution, risque de contamination croisée lorsqu’une plaque se déplace sur un poste. Corning recommande 75 à 200 µL pour ses plaques à fond plat comme à fond rond, et indique séparément 100 à 200 µL de milieu pour la 3596 traitée culture cellulaire. Greiner retient une fourchette plus large de 25 à 340 µL pour la CELLSTAR 655180, dont la construction à puits en cheminée sépare les puits voisins plus complètement qu’une surface supérieure commune.

Conséquence pratique : un protocole qui dit « remplir chaque puits à 300 µL » ne se transpose telle quelle à aucune de ces plaques sans vérification. Sur la Corning 3788, il dépasse le volume total du puits.

La surface de culture ne vaut pas 0,32 cm² partout

La surface de culture par puits est l’autre chiffre que les lecteurs viennent chercher, et il appartient lui aussi au fabricant plutôt qu’à la norme.

L’écart avoisine 6 %. Pour la plupart des usages, c’est du bruit. Pour tout ce qui se rapporte à l’unité de surface, non : densité d’ensemencement en cellules par cm², rendement protéique par cm², activité spécifique rapportée à la surface de culture. Un chiffre transmis d’un laboratoire à l’autre sur des plaques nominalement identiques hérite silencieusement de ces 6 %, et le « environ » dont Corning assortit sa valeur est un avertissement légitime plutôt qu’une précaution à ignorer.

Notez aussi ce dont la plaque à fond rond ne dispose pas. Corning indique une surface de culture pour la 3596 à fond plat traitée et aucune pour la 3788 à fond rond non traitée, ce qui est cohérent : la surface de culture est une propriété d’une surface destinée à la culture adhérente, non un fait géométrique sur un puits.

Lire un plan de plaque : de A1 à H12

Les rangées vont de A à H de haut en bas, les colonnes de 1 à 12 de gauche à droite, et un identifiant de puits associe la lettre de rangée au numéro de colonne. A1 est le puits en haut à gauche, H12 celui en bas à droite. La convention tient tout entière là-dedans, et la seule part qu’exigent les normes est le repérage du puits supérieur gauche.

Deux conséquences découlent du fait que le reste relève de l’usage et non de la spécification.

L’orientation est portée par la plaque, pas par le plan. Une plaque tournée de 180° dans un porte-plaque garde son coin A1 repéré, et ce repère est la seule chose qui indique à un lecteur ou à un opérateur de quel coin il s’agit. Un plan de plaque tracé sans marqueur A1 explicite reste ambigu exactement de la façon que la norme entendait éviter.

L’ordre de parcours est un choix local. Lire en colonnes (A1, B1, C1, etc.) et lire en rangées (A1, A2, A3, etc.) sont deux usages courants, les logiciels d’instruments divergent sur celui qu’ils exportent, et aucun n’est plus juste que l’autre. Il vaut la peine de préciser lequel adopte un jeu de données, car la différence transpose silencieusement une grille 8 × 12.

Ce que les normes laissent délibérément ouvert

L’ANSI/SLAS 6-2012 est la norme qui rend l’omission explicite, et elle mérite une lecture attentive parce que son titre laisse croire qu’elle fixe davantage qu’elle ne le fait. Elle s’applique aux microplaques à fond de puits plat et elle définit un vocabulaire : hauteur du fond de puits, variation de cette hauteur, variation à l’intérieur d’un puits, largeur du fond de puits, profondeur de puits, épaisseur de fond. L’objet qu’elle s’assigne est de décrire ces définitions et d’énoncer les conditions requises pour effectuer les mesures nécessaires.

C’est donc une norme de mesure. Sur la largeur du fond de puits, elle indique que la cote se mesure jusqu’au coin vif théorique et se rapporte comme valeur nominale. Définir comment rapporter une cote n’équivaut pas à exiger qu’elle prenne une valeur donnée, et rien dans les cinq normes n’en exige une.

Lus de près, les fournisseurs sont précis là-dessus. Greiner Bio-One indique que ses microplaques CELLSTAR présentent un encombrement uniforme conforme à la recommandation de l’American National Standards Institute, et nomme spécifiquement l’ANSI/SBS 1-2004. C’est une affirmation portant sur la norme d’encombrement, et c’est exactement celle que la norme soutient. La surface de culture de 34 mm² et le volume de travail de 25 à 340 µL figurant sur la même page sont des chiffres propres à Greiner, présentés comme spécifications produit et non comme conformité à quoi que ce soit.

La règle qui en découle, pour une section méthodes ou une légende de figure : citez la référence catalogue, pas le format. « Une plaque 96 puits » identifie l’encombrement et la position des puits. Elle n’identifie ni le volume, ni la surface de culture, ni la forme du fond, ni le traitement de surface, qui sont d’ordinaire les propriétés dont un lecteur aurait besoin pour refaire le travail.

Dessiner une plaque 96 puits conforme à la norme

Tracez-la à l’échelle 1:1 en millimètres et la spécification devient le dessin, au lieu d’être ce que le dessin approxime. Le contour est un rectangle de 127,76 sur 85,48 aux coins de rayon 3,18 mm. Le puits A1 se place à 14,38, 11,24. Tous les autres puits sont ce point augmenté d’un multiple de 9 dans chaque direction. La figure en tête de cette page est construite exactement sur ces valeurs et sur rien d’autre.

Quatre erreurs reviennent assez souvent dans les figures de plaques publiées pour mériter d’être nommées.

La grille transposée. Douze colonnes en largeur et huit rangées en hauteur. Une plaque dessinée en 12 rangées sur 8 colonnes est un autre objet, et le cas se produit surtout quand une figure est montée depuis un tableur dont l’orientation n’a jamais été vérifiée.

A1 dans le mauvais coin. En haut à gauche. Si une figure est reprise d’une photographie de plaque prise sur la paillasse, la plaque a très bien pu être tournée.

Des puits répartis d’un bord à l’autre. Espacer les puits régulièrement sur toute la largeur, au lieu de rentrer le premier centre de 14,38 mm puis d’avancer par pas de 9 mm, produit une plaque qui a l’air juste et ne correspond à rien. Ce sont les deux décalages qui centrent le réseau.

Un diamètre de puits présenté comme une spécification. Toute figure de plaque doit bien tracer les puits à une taille quelconque. Préciser quelle plaque a été dessinée, ou qualifier le diamètre de nominal, en est la version honnête. La figure ci-dessus retient la seconde.

Pour une figure qui porte des mesures, c’est la sortie vectorielle qui les préserve. Notre guide sur la préparation des figures scientifiques pour publication traite de la résolution, de l’épaisseur de trait et du corps typographique qui survivent à une réduction à une colonne de revue, et les mêmes règles valent pour un schéma de plaque comme pour un graphique.

Questions fréquentes

Quelles sont les dimensions d’une plaque 96 puits ? 127,76 mm × 85,48 mm, avec quatre rayons de coin de 3,18 ± 1,6 mm, d’après l’ANSI/SLAS 1-2004, et une hauteur typique de 14,35 mm ± 0,76 mm d’après l’ANSI/SLAS 2-2004. Une tolérance de ± 0,5 mm s’applique globalement, resserrée à ± 0,25 mm aux zones de référence, et les cotes valent à 20 °C.

Quel est l’entraxe des puits ? 9 mm entre centres, dans les deux directions. L’ANSI/SLAS 2-2004 tabule 9 mm pour 96 puits, 4,5 mm pour 384 et 2,25 mm pour 1536, chaque valeur étant la moitié de la précédente.

Où se situe le puits A1 ? En haut à gauche, centre à 14,38 mm de la référence du petit côté et 11,24 mm de celle du grand côté, avec une tolérance de position de ⌀0,70 mm. L’ANSI/SLAS 4-2004 exige que le puits supérieur gauche soit clairement repéré.

Quel volume contient un puits ? Cela dépend de la plaque, puisque aucune norme ne le fixe. Corning donne 360 µL pour la 3596 à fond plat et 330 µL pour la 3788 à fond rond ; Thermo Fisher donne 400 µL pour la Nunc 167008 à fond plat. Les volumes de travail recommandés sont de 75 à 200 µL pour les plaques Corning et de 25 à 340 µL pour la Greiner CELLSTAR 655180.

Quelle est la surface de culture d’un puits ? Environ 0,32 cm² chez Corning pour la 3596, et 34 mm² chez Greiner Bio-One pour la 655180. Ce sont des spécifications de fabricant, non des valeurs normalisées, et l’écart d’environ 6 % se propage dans tout résultat rapporté par unité de surface.

Le volume des puits est-il normalisé ? Non. L’ANSI/SLAS 6-2012 définit la profondeur de puits, l’épaisseur de fond et la largeur de fond de puits comme termes de mesure, et précise que la largeur de fond de puits est rapportée comme valeur nominale. Elle définit comment rapporter ces cotes, elle ne les fixe pas.

Combien de rangées et de colonnes ? Huit rangées de A à H, douze colonnes de 1 à 12. Thermo Fisher décrit la matrice comme 8 × 12.

Pour aller plus loin

Pour les règles de tracé qui décident si un schéma de plaque survit au passage à l’impression, voyez la préparation des figures scientifiques pour publication.

Si la figure de plaque part vers un résumé graphique, les contraintes de taille et de format viennent de la revue plutôt que de la plaque : les exigences des résumés graphiques recensent ce que demandent les grands éditeurs.

Si elle part vers un poster, comment réaliser un poster de recherche traite des formats de panneau et des corps typographiques qui restent lisibles à deux mètres.