Volcano-Plot-Generator

Welche Gene sich zwischen zwei Bedingungen verändert haben, wie stark und wie verlässlich, alles auf einmal. Jeder Punkt ist ein Gen: Seine Position von links nach rechts ist der log₂ Fold Change, seine Höhe der −log₁₀ des p-Werts. Je höher und weiter außen ein Punkt liegt, desto größer und sicherer die Änderung; die graue Basis nahe null sind die Gene, die sich nicht verändert haben.

Lesen Sie waagerecht Größe und Richtung der Änderung ab (rechts hoch, links herunter, ±1 ist eine Verdopplung oder Halbierung), dann senkrecht die Evidenz (1.3 entspricht p = 0.05, und jede Einheit darüber ist zehnmal kleiner). Treffer liegen in den beiden oberen Ecken außerhalb der gestrichelten Linien. Der Durchgang oben liest alle sechs Bereiche an einem Beispiel mit 20 Genen ab.

|log₂FC| ≥ 1, eine 2-fache Änderung, ist am häufigsten; 0.58 (1.5-fach) wird verwendet, wo kleine Effekte zu erwarten sind, etwa in Proteomik, Microarrays oder Single-Cell-Daten. Der Cutoff ist eine Entscheidung beim Berichten, nennen Sie ihn also in der Abbildungslegende. Im Volcano-Plot-Generator schreiben Sie ihn in den Prompt („|log2FC| > 0.58“) oder als N-fache Änderung („1.5-fold“), die in log₂ umgerechnet wird.

Denjenigen, auf den der Signifikanz-Cutoff angewendet wurde, damit die waagerechte Linie das bedeutet, was die Legende sagt. Bei Tausenden getesteten Genen filtern und plotten die meisten Arbeiten das nach Benjamini-Hochberg adjustierte p (padj, FDR, q). Der Volcano-Plot-Generator betitelt die Achse mit −log₁₀(adjustierter p-Wert), wenn die Werte adjustiert sind, sonst mit −log₁₀(p-Wert).

Weil mehr Gene hoch- als herunterreguliert wurden oder umgekehrt: Ein Volcano-Plot ist nur so symmetrisch wie die Biologie. Etwas anderes ist eine Verschiebung der ganzen grauen Basis weg von x = 0. Sie deutet meist auf ein Normalisierungsproblem hin, das Sie in einem MA-Plot prüfen sollten, bevor Sie die Treffer lesen. Der Volcano-Plot-Generator spiegelt die Punktwolke nie, damit sie ausgewogen aussieht.

Ihre p-Werte waren zu klein zum Speichern und wurden als 0 geschrieben, also ist −log₁₀ p unendlich, und die Plot-Software kappt sie auf eine Höhe. Das ist häufig bei p_val_adj aus Seurat und sehr tiefer RNA-seq. Der Volcano-Plot-Generator zeichnet diese Gene beim kleinsten von null verschiedenen p der Tabelle und vermerkt das in der Abbildung; sie als p < 10⁻³⁰⁰ zu berichten ist ehrlich, ein erfundener exakter Wert nicht.

Mit ggplot2 ergänzen Sie eine Klassenspalte (up, down, not significant), dann ggplot(res, aes(log2FoldChange, -log10(padj), colour = class)) + geom_point() + geom_vline(xintercept = c(-1, 1), linetype = 2) + geom_hline(yintercept = -log10(0.05), linetype = 2), mit ggrepel für die Labels. EnhancedVolcano bündelt dieselben Schritte in seinen Argumenten pCutoff und FCcutoff. Um den Code zu sparen, hängen Sie die mit write.csv() gespeicherte Tabelle an den Volcano-Plot-Generator an.

Prism zeichnet einen Volcano-Plot automatisch, wenn Sie eine gruppierte Tabelle mit multiplen t-Tests analysieren (ab Prism 8): Die Ergebnisse enthalten ein Diagramm der Differenz gegen −log₁₀ p. Aus einer anderswo erstellten Ergebnistabelle geben Sie den log₂ Fold Change als X und −log₁₀ p als Y in eine XY-Tabelle ein und ergänzen die Cutoff-Linien als zusätzliche Datensätze, oder Sie hängen diese Tabelle an den Volcano-Plot-Generator an.

In Excel ergänzen Sie neben den p-Werten eine Spalte =-LOG10(C2), erstellen ein Punkt (XY)-Diagramm des Fold Change gegen diese Spalte und fügen jede Cutoff-Linie als eigene Datenreihe aus zwei Punkten hinzu; die Klassen einzufärben kostet eine Datenreihe pro Klasse. In Python erledigt plt.scatter(df.log2FoldChange, -np.log10(df.padj), c=colours) mit plt.axvline und plt.axhline dasselbe, und adjustText platziert die Labels. Der Volcano-Plot-Generator nimmt dieselbe Tabelle als .xlsx oder .csv ohne Formelspalte.

Ja: Der Volcano-Plot-Generator liest Ergebnisse aus DESeq2, edgeR, limma, Seurat und Perseus anhand ihrer Spaltenüberschriften, aus .csv, .tsv oder .xlsx, bis zu 60.000 Zeilen. Zeilen mit NA werden übersprungen, das adjustierte p wird verwendet, wenn die Datei eines hat, und eine einfache Fold-change-Spalte wird in log₂ umgerechnet.

Nein: Der Volcano-Plot-Generator liest die p-Werte aus Ihrer Tabelle und rechnet nie selbst die Statistik. Führen Sie den Test in DESeq2, edgeR, limma oder Ihrer Proteomik-Software durch; aus diesen Zahlen berechnet der Volcano-Plot-Generator exakt −log₁₀ p, die Klasse jedes Gens, die Anzahlen, die Achsen und die Cutoff-Linien.

Standardmäßig beschriftet der Volcano-Plot-Generator die zehn signifikantesten Treffer, verteilt auf die hoch- und die herunterregulierte Seite. Schreiben Sie „label the top 20“, „no labels“ oder nennen Sie die Gene („highlight NANOG, SOX2 and MYC“); benannte Gene werden auch dann beschriftet, wenn sie grau sind.

Der Volcano-Plot-Generator nimmt bis zu 60.000 Zeilen, genug für ein ganzes Transkriptom. Bis 200 Gene wird jeder Punkt an seinen exakten Koordinaten platziert. Darüber werden die signifikantesten Gene (bis zu 300) exakt platziert und der Rest aus seinen wahren Anzahlen und seiner Streuung Band für Band gezeichnet, während die Legende die exakten Anzahlen für hoch, herunter und nicht signifikant behält.