ボルケーノプロット作成ツール

2 つの条件の間でどの遺伝子が、どれだけ、どれほど確かに変化したかを一度に示します。 点の 1 つひとつが遺伝子で、左右の位置が log₂ fold change、高さが p 値の −log₁₀ です。点が高く外側にあるほど、変化は大きく確かです。0 付近の灰色の裾野は、変化しなかった遺伝子です。

まず横方向で変化の大きさと向きを読み（右が上昇、左が低下、±1 が倍増か半減）、次に縦方向で証拠の強さを読みます（1.3 が p = 0.05 で、そこから 1 目盛り上がるごとに p は 10 分の 1 になります）。ヒットは破線の外側、左右の上の隅にあります。上の解説では、20 遺伝子の 1 つの例で 6 つの領域をすべて読んでいます。

最もよく使われるのは |log₂FC| ≥ 1、つまり 2 倍の変化です。プロテオミクス、マイクロアレイ、シングルセルのデータなど、効果が小さいと見込まれる場合は 0.58（1.5 倍）も使われます。 カットオフは報告上の選択なので、図の説明文に書いてください。ボルケーノプロット作成ツールでは、プロンプトに書くか（「|log2FC| > 0.58」）、N 倍の変化として書けば（「1.5-fold」）log₂ に換算します。

有意性のカットオフを適用したほうです。そうすれば横線が説明文どおりの意味になります。数千の遺伝子を調べるため、多くの論文は Benjamini–Hochberg 法で補正した p（padj、FDR、q）でしきい値を決めてプロットします。ボルケーノプロット作成ツールは、値が補正済みなら軸のタイトルを −log₁₀(adjusted p-value)、そうでなければ −log₁₀(p-value) にします。

低下より上昇した遺伝子が多い、あるいはその逆だからです。ボルケーノプロットの対称性は生物学的な結果のとおりにしかなりません。灰色の裾野全体が x = 0 からずれているのは別の問題です。たいていは正規化の問題を示しているので、ヒットを読む前に MA プロットで確かめる価値があります。ボルケーノプロット作成ツールが、釣り合って見えるように点の雲を左右反転させることはありません。

p 値が小さすぎて保存できずに 0 と書かれたため、−log₁₀ p が無限大になり、作図ソフトが 1 つの高さに押し込めているのです。Seurat の p_val_adj やとても深い RNA-seq でよく起こります。ボルケーノプロット作成ツールはそうした遺伝子を表の 0 でない最小の p の位置に描き、図にその旨を記します。p < 10⁻³⁰⁰ と報告するのは誠実ですが、正確な値をでっち上げるのはそうではありません。

ggplot2 なら、分類の列（up、down、not significant）を加えてから、ggplot(res, aes(log2FoldChange, -log10(padj), colour = class)) + geom_point() + geom_vline(xintercept = c(-1, 1), linetype = 2) + geom_hline(yintercept = -log10(0.05), linetype = 2) と書き、ラベルには ggrepel を使います。EnhancedVolcano は同じ手順を pCutoff と FCcutoff の引数にまとめています。コードを省きたいなら、write.csv() で保存した表をボルケーノプロット作成ツールに添付してください。

Prism（Prism 8 以降）では、グループ化した表を複数の t 検定で解析すると、ボルケーノプロットが自動で描かれます。結果には差を −log₁₀ p に対して描いたグラフが含まれます。ほかで作った結果表からなら、XY 表の X に log₂ fold change、Y に −log₁₀ p を入れ、カットオフ線を別のデータセットとして加えるか、その表をボルケーノプロット作成ツールに添付してください。

Excel では、p 値の横に =-LOG10(C2) の列を加え、倍率に対するその列の散布図を作り、カットオフ線はそれぞれ 2 点の系列として加えます。分類ごとに色を分けるには、分類ごとに 1 系列が必要です。Python では plt.scatter(df.log2FoldChange, -np.log10(df.padj), c=colours) に plt.axvline と plt.axhline で同じことができ、ラベルは adjustText で配置します。ボルケーノプロット作成ツールは同じ表を .xlsx か .csv のまま、数式の列なしで受け付けます。

読めます。ボルケーノプロット作成ツールは DESeq2・edgeR・limma・Seurat・Perseus の結果を列の見出しから読み取ります。 .csv・.tsv・.xlsx で 60,000 行まで対応します。NA の行は飛ばし、補正後の p があればそれを使い、通常の Fold change の列は log₂ に換算します。

しません。ボルケーノプロット作成ツールは表から p 値を読むだけで、統計検定は行いません。 検定は DESeq2、edgeR、limma やプロテオミクスのソフトで行ってください。その数値から、ボルケーノプロット作成ツールが −log₁₀ p、各遺伝子の分類、個数、軸、カットオフ線を正確に計算します。

既定では、ボルケーノプロット作成ツールは発現上昇側と低下側に分けて、最も有意な 10 個のヒットにラベルを付けます。 「label the top 20」「no labels」と書くか、遺伝子を指定してください（「highlight NANOG, SOX2 and MYC」）。指定した遺伝子は灰色でもラベルが付きます。

ボルケーノプロット作成ツールは 60,000 行まで受け付けるので、トランスクリプトーム全体でも扱えます。 200 遺伝子までは、すべての点を正確な座標に置きます。それを超えると、最も有意な遺伝子（300 個まで）を正確に配置し、残りは実際の個数と広がりから帯ごとに描きます。凡例には発現上昇、発現低下、有意でないものの正確な個数がそのまま記されます。